Категории

Методы выявления возбудителя

Костюк С А - Изучение частоты выявления возбудителей инфекций урогенитального тракта у половых па

Методы выявления возбудителя

Диагностика туберкулеза. Специальные методы выявления и диагностики туберкулеза.

Выявление микобактерий туберкулеза.


  Возбудителем туберкулеза является микобактерия туберкулеза (МБТ) - патогенный микроорганизм из рода Micobacterium семейства Actinomycetacae (лучезарные грибы). Различают 3 группы микобактерий:

·истинные микобактерии - патогенны для человека;

·кислотостойкие условно-патогенные микобактерии (атипичные);

·кислотостойкие сапрофиты.

  Среди истинных микобактерий, в зависимости от патогенности для человека и разных видов животных, выделяют такие типы:

·M. tuberculosis - человеческий тип, возбудитель туберкулеза человека;

·M. bovis - бычий тип, возбудитель туберкулеза крупного рогатого скота;

·M. africanum - африканский тип, выделенный в западной тропической Африке, ему присущие черты двух предыдущих типов.
  M. tuberculosis имеют вид тонких, несколько выгнутых, гомогенных или зернистых палочек длиной 0,8-5 мкм, толщиной 0,3-0,5 мкм. МБТ не образуют спор и капсул. Грам-положительные. Важным их свойством является кислото-, щелоче-, спиртостойкость. МБТ - факультативные аэробы, для их нормального развития нужен кислород. Размножение происходит путем простого деления, реже почкованием. Цикл простого деления материнской клетки на два дочерних длится 20-24 часа. Различают популяции, которые размножаются быстро, медленно и находятся в латентном состоянии. Популяции МБТ с разной активностью имеют разную чувствительность к антибактериальным препаратам. Микробная клетка имеет микрокапсулу, цитоплазматичну мембрану, цитоплазму с органелами (гранулы, вакуоля, рибосомы), ядром.

Методы выявления МБТ

1. Бактериоскопический:

·прямая бактериоскопия;

·флотация;

·люминесцентная микроскопия .

2. Бактериологический (культуральный):

·занял на питательную среду .

3. Биологический .

Прямая бактериоскопия - один из основных методов выявления МБТ, простой, общедоступный, быстрый.Прямую бактериоскопию мокротыможно осуществить в условиях любой лаборатории. Недостатком метода является то, что МБТ можно обнаружить лишь при их значительном количестве - 50 000-100 000 и больше микробных тел у 1 мл патологического материала.
Методика расцветки мазка за Цилем-Нильсеном основывается на кислото-, щелоче-, спиртостойкости возбудителя - способности МБТ после расцветки фуксином удерживать краситель даже после длительного обесцвечения кислотой или спиртом, в отличие от другой микробной флоры.
Методика:

·на предметном стекле делают тонкий мазок из мокроты и высушивают над пламенем горелки;

·на фиксированный препарат налагают полоску фильтровальной бумаги, сверху наливают раствор карболового фуксину и нагревают над пламенем горелки к появлению паров;

·смывают остатки краски водой;

·обесцвечивают мазок в 20%-ом растворе серной кислоты или в 3%-ом солянокислом спирте к розово-сероватому цвету, промывают водой;

·докрашивают 30 секунд 0,025%-м раствором метиленового синего.
На высушенный мазок наносят каплю оливкового или касторового масла и осматривают через імерсійну систему микроскопа. Под микроскопом МБТ имеют вид палочек красного цвета на синем фоне препарата. Для повышения вероятности нахождения МБТ исследования харкотиння проводят не меньше 3-х раз.

Метод флотации основывается на том, что при взбалтывании водной суспензии харкотиння с углеводородом (ксилол, бензин, бензол, толуол) микобактерии прилипают к каплям углеводороду. Углеводород легче воды и потому всплывает на поверхность в виде пены, в которой концентрируются микобактерии (флотаційне кольцо). Из флотаційного кольца берут материал, из которого готовят мазок по принципу толстой капли (наслоение 3-4 мазков с предыдущим высушиванием). Мазок окрашивают за Цилем-Нильсеном. При применении метода флотации МБТ находят на 10-15% чаще, чем при обычной бактериоскопии.

Люминесцентный метод основывается на способности липидов МБТ воспринимать люминесцентные красители, а затем светиться под ультрафиолетовыми лучами. В зависимости от красителя, МБТ светятся ярко-красным цветом на зеленом фоне или золотисто -жовтим - на темно-зеленом. Применяют такие красители: акридин, смесь аурамінуООсродаміном. Мазок осматривают под специальным люминесцентным микроскопом. Метод люминесцентной микроскопии повышает возможность выявления МБТ на 14-30%, сравнительно с прямой бактериоскопией, и на 8% - сравнительно с флотацией.

Бактериологический метод значительно чувствительнее, позволяет обнаружить МБТ, если в 1 мл мокроты находится 20-100 микробных тел. Значительным преимуществом метода является возможность выделить чистую культуру МБТ, идентифицировать их, определить чувствительность к противотуберкулезным препаратам. Рост МБТ на питательной среде свидетельствует об их высокой жизнеспособности. Недостатком метода является медленный рост микобактерий. Существуют разные питательные среды - тверди, полужидкие, жидкие. Чаще применяют твердые яичные среды - Левенштейна -Йенсена, Финна-2, Гельберга, Петроньяни. В состав среды Левенштейна-Йенсена входит: солевая основа - соли Mg, K, L-аспарагін, глицерин, яичная масса, 2%-й раствор малахитовой зелени. Среда Финна-2 вместо L-аспарагина содержит глутаминат натрию. На среде Финна-2 рост микобактерий появляется на несколько дней раньше, чем на среде Левенштейна-Йенсена.
Для притеснения неспецифической флоры перед посевом мокроты обрабатывают 2-6%-м раствором серной кислоты или 4%-м раствором едкого натрия, 10%-м раствором фосфата натрия. Пробирки с посеянным материалом вмещают в термостат при 37°С. Первые колонии появляются на 18-30-й день культивирования, максимально до 2-2,5 месяцев. Потому материал выдерживают в термостате 3 месяца с пересмотром посевов каждые 7-10 дней. На твердых питательных средах МБТ растут в виде сухих безпигментых R-колоний. На фоне химиотерапии могут выделяться культуры с гладким влажным ростом (S-колонии).
Биологический метод
(заражение лабораторных животных) позволяет обнаружить МБТ при минимальном количестве (5 микробных тел) в 1 мл мокроты. Однако микобактерии, стойкие к химиопрепаратам, в частности изоніазида, авирулентные для морских свинок. При применении интенсивной антибактериальной терапии больных, заражение животных может дать негативные результаты.Мокрота или другой материал обрабатывают 3-4%-м раствором серной кислоты для уничтожения неспецифической микрофлоры, после чего тщательным образом промывают стерильным физраствором от остатков серной кислоты. Осадок растворяют в физрастворе и вводят морской свинке подкожно. Для повышения частоты выявления МБТ можно вводить материал в яичко; или одновременно с заражением свинки вводить ей кортизон, который подавляет защитные силы организма. При наличии в введенном свинце материале вирулентных микобактерий через 2 недели в участке заражения появляется инфильтрат, через месяц увеличиваются лимфатические узлы, через 3 месяца развивается генерализованный туберкулез.Для биологического определения МБТ нужные условия для содержания лабораторных животных и потому в практических лечебных заведениях его применяют редко.
Нахождение МБТ в патологическом материале больного, в частности в мокроте, имеет большое значение для установления епидемиологическойопасности больного. Количество МБТ в мазке или колоний на питательной среде, их уменьшение в процессе химиотерапии является ориентировочным показателем эффективности лечения. Если количество МБТ не уменьшается, это может свидетельствовать о развитии стойкости и необходимости коррекции комбинации химиопрепаратов.С целью установления наявности или отсутствия бактериовыделения каждый больной перед началом лечения подлежит комплексному бактериологическому обследованию:

·три раза прямая бактериоскопия мокроты или промывных вод бронхов;

·при негативных результатах - три раза исследование методом флотации;

·независимо от результатов этих исследований - три раза посев мокроты на питательную среду с определением медикаментозной стойкости выделенной культуры МБТ;

·в процессе лечения исследования повторяют один раз на месяц после предыдущей отмены препаратов на протяжении 2-х дней - к прекращению бактериовыделения, а в дальнейшем - один раз на 2-3 месяца до окончания основного курса химиотерапии. Бактериовыделителем считают больного, у которого найденаМБТ любым методом один раз при наличии клинико-рентгенологических признаков активности процесса, а при отсутствии этих признаков - 2 раза любым методом. В таких случаях источником выделения МБТ могут быть эндобронхит, прорыв казеозного лимфатического узла в просвет бронха или распад небольшого очага, который тяжело обнаружить рентгенологически. Прекращение бактериовыделения подтверждается не менее чем двумя последовательными негативными бактериоскопиями и посевами с интервалом 2-3 месяца.

Определение чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам имеет важное значение для тактики химиотерапии, контроля за эффективностью лечения и прогноза заболевания. Изменение чувствительности МБТ наблюдается ко всем туберкулостатиков. Чувствительность МБТ к химиопрепаратам определяется минимальной концентрацией препарата, которая задерживает рост МБТ при стандартных условиях опыта. В бактериологических лабораториях для определения чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам применяетсяметод абсолютных концентраций на твердой питательной среде Левенштейна-Йенсена. Получают чистую культуру МБТ, выделенную от больного. Во время приготовления твердой среды к нему добавляют противотуберкулезные препараты в разных разведениях. В пробирки со средой, которые содержат разную концентрацию препаратов, и в одну контрольную, без туберкулостатика, засевают суспензию культуры МБТ (500 млн. микробных тел в 1 мл). Культуру считают чувствительной, если в пробирке с препаратом выросло меньше 20 колоний при обильном росте в контроле. Если выросло более 20 колоний, культуру считают стойкой.
Результаты определения чувствительности и стойкости МБТ называют антибиограммой. Штаммы считают стойкими, если они дают рост при таких концентрациях у 1 мл среды: изониазид - 1 мкг, рифампицин - 20 мкг, стрептомицин - 5 мкг, етамбутол - 2 мкг, все другие препараты - 30 мкг .


Для этиологической идентификации туберкулеза на данное время применяют также молекулярно-генетические и иммунологические методы. Одним из наиболее достоверных признаков подтверждения наличия возбудителя туберкулеза является выявление специфических антигенов МБТ в патологическом материале больных (мокроте, плевральная жидкость, ликвор, сыворотка крови). Микобактерии и их фильтраты - это сложная комбинация антигенов, которые представлены протеинами, полисахаридами, липидами.Антигенные препараты культур МБТ применяют для получения специфических сывороток и моноклональных антител при создании диагностикума, предназначенного для определения микобактериальных антигенов в клиническом материале.

Наболееперспективными есть имуноферментный и радиоиммунный методы определения микобактериальних антигенов, которые основываются на применении моноклональных антител.Молекулярно-генетический метод полимеразной цепной реакции заключается в выявлении в биологическом материале ДНК микобактерий. Даже при минимальном количестве микробных клеток (5-10) в исследуемом материале с помощью специфических праймероволигонуклеотида запускают синтез специфических фрагментов ДНК в специальном циклотермостаті, которые позже идентифицируют методом гельэлектрофореза. Исходным материалом может быть мокрота, лаважная, спинномозговая, плевральная жидкости, содержание желудка, ткани, обеззараженные нагреванием с неограниченным сроком хранения. Результаты исследований получают через 3-4 часа.

Клинические методы


 Разнообразиепроявлений туберкулеза зависит от стадии и распространения процесса, а также от локализации специфических изменений в легких или других органах.  При начальных формах заболевания не вызывает никаких субъективных болезненных ощущений, и при них не находят патологических изменений во время обычного клинического обследования. Потому часто ранняя диагностика возможна лишь при применении специальных методов исследования: рентгенологически, туберкулинодиагностики, микробиологических, инструментальных, а при необходимости - биоптических с гистологической верификацией диагноза.
Если же заболевание сопровождается клиническими симптомами, они предопределены интоксикационным синдромом и местными проявлениями, связанными с поражением определенного органа (в 86% - это органы дыхания).
Туберкулезная интоксикация предопределена эндотоксинами, которые выделяются во время разрушения микробных клеток, а также продуктами распада белков в пораженном органе. Ее проявления - это общая слабость, сниженная работоспособность, ухудшение аппетита, потеря массы тела, потливость, нарушение сна, раздражительность, повышенная температура тела.
Потливость
в начале заболевания выражена незначительно. Профузные поты, особенно ночью, свойственные формам заболевания с массивными экссудативными и казеозными изменениями.
Температура тела
при туберкулезе может быть нормальной, субфебрильною, высокой и даже хектическою. Однако чаще всего она колеблется в границах от 37°С к 38,5°С. Для нее характерная большая лабильность (повышение во время труда, менструации), отсутствие монотонности. Больные часто почти не чувствуют повышенной температуры тела, продолжают работать в привычном режиме.
Местные проявления заболевания, связанные с поражением органов дыхания, - это кашель, выделение мокроты, кровохарканье, боль в грудной клетке, одышка.Кашель является самым частым симптомом у больных туберкулезом легких. Сначала - это легкое покашливание, на которое больной не обращает внимания или связывает с курением, простудой. Безудержный, приступообразный сухой кашель может быть проявлением туберкулез ногоэндобронхита, хотя чаще наблюдается при раке легких. Кашель, что длится 3-4 недели, должен быть показанием для флюорографического обследования. В начале заболевания мокрота может не выделяться или его очень мало. При хронических деструктивных формах туберкулеза больной может выделять до 100-200 мл мокроты на сутки. Оно слизевого или слизисто-гнойного характера, но почти никогда не имеет такого неприятного запаха, как при неспецифических гнойных процессах.
Кровохарканья и кровотечения
обычно бывают при деструктивных изменениях в легких или при вторичных бронхоэктазах, которые формируются в процессе фибротизации специфических изменений (см. "Осложнение туберкулеза органов дыхания"). Одышка не свойственная начальным проявлениям туберкулеза и наблюдается лишь при милиарном туберкулезе и экссудативном плеврите. Она часто сопровождает хронические процессы, усложненные дыхательной или легочно-сердечной недостаточностью, может также быть симптомом спонтанного пневмоторакса.

Боль в груди при туберкулезе обычно неинтенсивный, предопределенный переходом процесса на плевру, усиливается при дыхании, кашле. Тупая, ноющая боль бывает при цирротических процессах в легких. Острая, внезапная боль возникает при спонтанном пневмотораксе.
При внелегочных формах туберкулеза, кроме общих симптомов, предопределенных интоксикацией, бывают и местные проявления заболевания. При туберкулезе нырок - это боль в поясничном участке, при туберкулезе мочевого пузыря - дизурические расстройства, при мезадените - боль внизу живота и нарушения менструального цикла, при менингите - боль головы, блюет. Однако при начальных стадиях некоторых внелегочных форм туберкулеза у больных не может не быть никаких жалоб.
Анамнез
. Начало заболевания при туберкулезе бывает постепенным, незаметным и редко - острым, что важно для дифференциации туберкулеза с острыми неспецифическими воспалительными процессами.
Опрашивая пациента, необходимо выяснить, был ли у него контакт с больным туберкулезом (особенно семейный), потому что лица, которые проживают в очаге туберкулезной инфекции, в 5-10 раз чаще болеют туберкулезом (особенно это касается детей, которые живут в неблагоприятных санитарно-бытовых условиях). Кроме того, имеют значение ведомости о перенесенных в прошлом болезнях ("грипп" или рецидивирующая пневмония, под маской которых может перебегать туберкулез, экссудативный плеврит туберкулезной этиологии), сопроводительных заболеваниях, которые повышают риск эндогенной реактивации туберкулеза (сахарный диабет, язвенная болезнь желудка, хронические психические заболевания, лечение иммунодепрессивными препаратами и тому подобное), недавние беременности, роды. Имеет значение труд во вредных условиях, избыточное курение, злоупотребление алкогольными напитками, наркомания. У взрослых людей необходимо выяснить дату и результаты предыдущего флюорографического обследования, потому что давние неактивные посттуберкульозные изменения в легких при определенных обстоятельствах могут стать источником реактивации туберкулеза. Относительно детей, необходимо получить сведения о прививке БЦЖ, результаты туберкулинодиагностики.
Обзор
. При начальных формах туберкулеза обзор пациента не обнаруживает видимых отклонений от нормы. На более поздних стадиях возможная бледность кожи, иногда цианоз, исхудание, даже кахексия. Во время обзора детей нужно выяснить, на ли левом плече есть рубцы после прививок БЦЖ, их количество. Порой у детей с первичным туберкулезом находят так называемые параспецифические проявления: узловатую эритему (часто на передней поверхности голеней), керато-конъюнктивит, фликтены. При обзоре обращают внимание на увеличенные периферические лимфатические узлы, свищи или рубцы после них (обычно на шее), послеоперационные рубцы.
Сравнивают симметричность и участие обеих половин грудной клетки в дыхании, выраженность над- и подключичных ямок. Обращают внимание на локализацию верхушечного толчка. В результате цирротических изменений легкое сморщивается и сужается соответствующая половина грудной клетки, верхушечный толчок смещается в пораженную сторону. При хронических формах туберкулеза, особенно при их осложнении амилоидозом, ногти приобретают форму "часовых стекол", редко - "барабанных палочек". Последний симптом чаще является признаком неспецифического гнойного процесса. Обнаруживают возможные деформации костей, подвижность суставов.
С помощью пальпации определяют тургор кожи, тонус мышц, толщину подкожного жирового слоя. Пальпируют периферические лимфатические узлы шеи, локтевые, декабре, подмышечные и паховые. У детей с первичным туберкулезом можно обнаружить микрополиаденит - незначительно увеличенные мягко-эластичные лимфатические узлы больше чем в 5 группах. С помощью "вилочкового " симптома, поместив два пальца над грудиной по бокам трахеи, можно обнаружить ее смещение, которое бывает при одностороннем циррозе легкие, ателектазе . Голосовое дрожание усилено над зонами инфильтрации или же цирроза, ослаблено - при экссудативном плеврите, пневмотораксе.Тщательным образом пальпируют органы живота, определяют размеры печенки, селезенки, возможное увеличение мезентериальных лимфатических узлов. Перкуссию легких проводят сначала сравнительную, позже - топографическую. Притупленный перкуторний звук при туберкулезе легких оказывается чаще в верхних отделах, при экссудативном плеврите - в нижних. Однако нужно помнить, что при распространенных диссеминированных формах туберкулеза легких небольшие участки уплотнения чередуются с участками, которые хорошо наполнены воздухом, потому изменения перкуторного звука обнаружить тяжело. Тимпаничний оттенок перкуторного звука бывает над напряженным спонтанным пневмотораксом, гигантской каверной с гладкими стенками. Коробочный перкуторний звук (чаще над нижними участками легких) является признаком компенсаторной эмфиземы. Топографическая перкуссия позволяет определить границы легких, размеры и размещения средостения, а также локализацию и размеры патологического процесса в легких.

Аускультацию проводят последовательно над симметричными участками легких при спокойном, глубоком дыхании и после легкого покашливания. Во избежание инфицирования, врач должен проводить аускультацию, стоя сбоку от больного. Обращают внимание на тип дыхания (везикулярное, бронхиальное) и дополнительные шумы (влажные или сухие хрипы, крепитация).При ранних формах туберкулеза аускультивных изменений над легкими не обнаруживают, или они мизерные: "должно было слышать и много видно на рентгенограмме ". Над туберкулезным инфильтратом дыхания обычно шершавое или ослаблено. Бронхиальный тип дыхания может прослушиваться при массивном циррозе, редко - над большими кавернами; резко ослаблено или отсутствующее дыхание - над плевральным экссудатом или воздухом при пневмотораксе.
Наибольшее диагностическое значение имеют локальные влажные хрипы, которые иногда прослушиваются лишь после покашливания. Особенно тщательным образом нужно выслушивать так называемые "зоны тревоги": спереди над и под ключицей, сзади над верхушкой легких, возле ости лопатки и между лопатками. Эти места отвечают проекции 1, 2 и 6 сегментов, в которых чаще всего локализуется туберкулезный инфильтрат.Если средне- или крупнопузырчатые хрипы прослушиваются над верхними отделами легких, они являются обычно признаком полости распада. Сухие свистящие хрипы над ограниченным участком легких могут прослушиваться при туберкулезе бронха, но у лиц с неуточненным диагнозом они могут быть признаком злокачественной опухоли. Рассеянные сухие хрипы над всей поверхностью легких - признак неспецифического бронхита, однако нужно помнить, что бронхит является частым сопроводительным заболеванием при туберкулезе легких. При фибринозном плеврите выслушивают шум трения плевры.
Аускультация сердца может обнаружить акцент II тона или его раздвоения над легочным стволом, что является признаком гипертензии в малом кругу кровообращения и хронического легочного сердца.
Обследуя пациента, необходимо помнить, что у больных туберкулезом могут быть сопроводительные заболевания легких и других органов, которые проявляются соответствующими клиническими симптомами.

Рентгенологически диагностика


  Рентгенологически методы принадлежат к основным (а не дополнительных) для диагностики туберкулеза легким. Они играют также большую роль в диагностике внелегочных форм туберкулеза: почек, костей и суставов, половых органов. Флюорография широко применяется при массовых обследованиях населения. Она имеет большую пропускную способность, позволяет уменьшить затраты на рентгеновскую пленку. Информативность качественно выполненной флюорографии приближается к рентгенографии, ее можно выполнить в разных проекциях. Потому в последнее время флюорография используется и как диагностический метод. При флюорографии пациент получает несколько большую дозу облучения, чем при рентгенографии, потому детям проводят лишь рентгенографию, а не флюорографию.

.

ТУБЕРКУЛИНОДИАГНОСТИКА

Туберкулиновые пробы являются специфическим диагностическим тестом, который базируется на свойстве туберкулина вызывать в организме человека, который сенсибилизирован МБТ, воспалительные реакции замедленного типа. Их применяют для массового обследования на туберкулез детей и подростков, а также для диагностики, дифференциальной диагностики туберкулеза и определения активности процесса.

В Украине ППД выпускают в виде готового для применения раствора, стерильность которого обеспечивается наличием в нем 0,01 % хинозола. Раствор был расфасован в ампулах по 3 мл (30 доз) или в флаконах по 5 мл (50 доз). Каждая доза – 0,1 мл содержит 2 ТО. Для стабилизации биологической активности раствора добавляется твина-80. Соответственно международному стандарту ВООЗ1 ТО вмещает 0,00006 мгППД-Л или 0,00002 PPD-S.

Туберкулин является неполным антигеном и поэтому не вызывает образования антител, но предопределяет реакцию в сенсибиллизированном организме полным антигеном (МБТ, вакцинным штаммом БЦЖ).

В зависимости от способа введения туберкулина различают кожную пробу Пирке (Pierquet, 1907), внутрикожную – Манту (Mantоux C., 1910, Mendel F., 1909) и подкожную пробу Коха (Koch, 1890).

При массовых обследованиях на туберкулез используют пробу Манту, в условиях клиники с целью диагностики и для определения активноституберкулезного процесса – пробу Коха. Проба Пирке потеряла свою диагностическую ценность и теперь используется чрезвычайно редко.

В основе реакции организма на туберкулин имеется иммунологическая реакция повышенной чувствительности замедленного типа (ПЧСТ). После инфицирования МБТ (вакцинации или ревакцинации) гиперчувствительность к туберкулину появляется, в среднем, через 6-8 недель. Интенсивность реакции на туберкулин зависит от степени специфической сенсибилизации организма и его реактивности, а также от разных эндогенных и экзогенных факторов.

Различают массовую и индивидуальную туберкулинодиагностику.

Цель массовойтуберкулинодиагностики:

1. раннее выявление туберкулеза;

2. выявление лиц с повышенным риском заболевания на туберкулез;

3. отбор контингентов для ревакцинации БЦЖ;

4. определение показателя инфицированности населения МБТ;

5. дифференциальная диагностика между инфекционной и послевакцинной аллергией.

Для решения этих заданий применяют пробу Манту с 2 ТО очищенного туберкулина в стандартном разведении. Для этого используют од-нограммовый стерильный шприц и иглу одноразового использования. Набирают длинной иглой 0,2 мл туберкулина, а затем заменяют ее на малую и выпускают туберкулин к метке 0,1 мл. Кожу средней трети внутренней поверхности предплечья протирают 700 спиртом, фиксируют, и повернув иглу срезом вверх, вводят внутрикожно 0,1 мл (2 ТО) раствору туберкулина.

Результаты пробы Манту, которые оценивают через 72 часа, могут быть такими:

1. негативная – отсутствие инфильтрата или лишь знак после инъекции до ;

2. сомнительная –инфильтрат диаметром 2- или лишь гиперемия;

3. позитивная –инфильтрат розмером и больше (рис. 3) ;

4. Гиперэргическая– у детей и подростков инфильтрат и больше, у взрослых – и больше, а также для разных возрастных групп, реакции с наличием везикул, некроза или лимфангита, независимо от размеров инфильтрату.

При безиголочномметоде размер инфильтрата на меньше, чем при инъекции туберкулиновой иглой и соответственно дается интерпретация реакции. С целью раннего выявления туберкулеза, виражу туберкулиновой реакции пробу Манту с 2 ТО проводят всем детям из 12-лунного возраста и подросткам, повторяют ежегодно, независимо от предыдущего результата. В парные годы пробу проводят на правом, в непарные – на левом предплечье, в одно и то же время (лучше осенью).

Инфекционная аллергия: впервые положительная реакция ( и больше) у детей, не привитых предыдущего года; стойкое сохранение в течение нескольких лет реакции на туберкулин с размером инфильтрата и больше; увеличение интенсивности предварительно сомнительных или позитивных реакций на туберкулин на и больше; гиперэргические реакции.

Контакт с больным туберкулезом, сочетание впервые зарегистрированной позитивной пробы Манту с наличием клинических признаков заболевания свидетельствует о первичном инфицировании МБТ (вираж туберкулиновой реакции), туберкулезной интоксикацией или даже локальным специфическим процессом.

Туберкулиновый вираж – это появление впервые позитивной реакции на туберкулин после негативной в пределах одного года или ее усиления у привитых вакциной БЦЖ на и больше.

Источник: http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/propedeutic_vn_des/lectures_stud/ru/stomat/ptn/Фтизиатрия/4/Подготовка/Лекция_02_ диагностика туб. 13.4.htm

Методы прямого обнаружения возбудителя и его антигенов

Общие свойства мокроты и ее микроскопия. До того как мокрота будет исследована на наличие микобактерий, лаборант по ее внешнему виду определяет количество, запах, цвет, консистенцию, характер. Жидкую мокроту, состоящую из гнойных клеток, определяют как гнойную; мокроту с преобладанием гноя или слизи — как гнойно-слизистую или сли-зисто-гнойную; мокроту без гноя, содержащую только слизь, как слизистую, содержащую только кровь,— как кровянистую, а с примесью слизи и гноя — как кровянисто-слизисто-гнойную.

По консистенции мокрота может быть тягучей, студенистой, умеренно вязкой, жидкой.

В мокроте могут быть примеси, заметные невооруженным глазом: фибринозные слепки бронхов, кусочки ткани, бело-желтоватые комочки (дитриховские пробки), зерна «чечевицы» или «линзы» из омертвевшей ткани, детрита эластических волокон, беловатые полоски, свидетельствующие об обызвествленном распаде, пленчатые образования (эхинококк) и другие включения.

Далее под микроскопом исследуют нативный препарат мокроты, для чего готовят 2 препарата на одном предметном стекле и накрывают двумя покровными стеклами. Исследование проводят при малом увеличении (объектив 10, окуляр 7) и с объектом 40.

В нативном препарате определяют наличие лейкоцитов, эозинофилов, эритроцитов, клеток эпителия, эластических и других видов волокон и прочих элементов.

Для диагностики туберкулеза большое значение имеет обнаружение в препарате эластических волокон, присутствие которых указывает на разрушение ткани. Эластические волокна в мокроте могут быть и при других заболеваниях (например, при абсцессе легких, новообразованиях, эхинокок-козе и др.). Под микроскопом эластические волокна имеют вид длинных, блестящих волокнистых образований равномерной толщины.

При наличии каверны эластические волокна покрываются мылами и приобретают вид кораллов. Коралловидные волокна образуются при наличии в каверне жира, солей кальция и магния, образующих мыла, которые и покрывают эластические волокна. Если в мокроту добавить 10 % раствор едкой щелочи, то мыла очищаются и выявляются обычные эластические волокна.

Большое диагностическое и прогностическое значение имеет выявление в препарате так называемой тетрады Эрлиха, в которую входят следующие элементы:

  • 1) обызвествленные эластические волокна,
  • 2) обызвествленные частицы жирового распада,
  • 3) кристаллы холестерина,
  • 4) измененные микобактерии туберкулеза.

Такие элементы в мокроте наблюдаются при распаде старых обызвествленных очагов.

Методы обнаружения и выделения возбудителя туберкулеза. Наиболее надежным подтверждением диагноза туберкулеза является обнаружение возбудителя в выделениях больного или взятых из организма материалах.

Основным материалом для исследования является мокрота. При отсутствии мокроты исследуют слизь из гортани или промывные воды бронхов, иногда — промывные воды желудка. Исследованию подлежат также моча, кал, спинномозговая жидкость, экссудат из плевральной полости, ас-цитическая жидкость, пунктат из закрытых натечников. При необходимости исследуют кусочки тканей или органов, взятые у больных во время операции. Материал для исследования должен быть взят с соблюдением правил асептики.

Результаты исследований во многом зависят от правильности сбора материала, его обработки и хранения. Важное значение имеет и правильное приготовление мазков или материала для посева на питательные среды.

Для обнаружения МТ в выделениях больного применяют бактериоскопический (микроскопия мазков), бактериологический (посев материала на питательные среды) и биологический (заражение лабораторных животных) методы.

Сбор и подготовка материала для исследования.

Мокрота. Следует собирать утренние порции мокроты и исследовать ее в тот же день. Если у больного мало мокроты, то ее собирают в течение дня (суточная мокрота). Для усиления секреции мокроты применяют раздражающую аэрозольную ингаляцию, для чего используют аэрозольный ингалятор типа АИ-1. Для ингаляции рекомендуется 15 % раствор натрия хлорида в 1 % растворе натрия гидрокарбоната. Ингалируют 30—60 мл раствора, нагретого до 42—45 °С. Индивидуальные мерные стаканчики и мундштуки подлежат дезинфекции. При отсутствии мокроты у больных получают промывные воды бронхов. У детей чаще исследуют промывные воды желудка, так как они плохо откашливают мокроту и заглатывают ее.

Лучше исследование мокроты проводить до начала лечения ежедневно в течение 3 дней подряд. Объяснить больному, что он должен собирать не носоглоточную слизь и слюну, а отделяемое из верхних дыхательных путей при кашле.

Перед сбором мокроты больной должен прополоскать рот и зев кипяченой водой. Мокрота должна быть собрана в стерильную плевательницу. Промывные воды бронхов получает врач-ларинголог. Для микроскопии и посева используют осадок, полученный при центрифугировании промывных вод.

Моча. В мочу могут попасть непатогенные микобактерии смегмы, которые имеют морфологическое сходство с мико-бактериями туберкулеза. Поэтому перед взятием мочи необходим тщательный туалет наружных половых органов. Утреннюю мочу следует брать стерильным катетером в стерильную посуду. Если результат утренней порции мочи отрицателен, то 2—3 дня подряд берут суточную порцию мочи, которую отстаивают в течение ночи, верхний слой сливают, а остаток центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин. Осадок используют для приготовления мазка и посева.

Кал. В хлопьях слизи и гноя можно обнаружить микобактерии туберкулеза (методом бактериоскопии и посева).

Спинномозговая жидкость. Ее оставляют на сутки при комнатной температуре. На поверхности жидкости образуется фибринозная пленка, из которой и делают мазок на стекле. При отсутствии пленки жидкость центрифугируют при 2000 об/мин в течение 30 мин, после чего ее сливают, а из осадка делают мазок.

Бактериоскопия (микроскопия) мазков. Микроскопическое исследование мазков является наиболее простым, доступным, дешевым и быстрым методом обнаружения микобактерий. Он остается одним из основных методов исследования.

Недостатком прямой бактериоскопии окрашенных мазков является низкая чувствительность метода. При микроскопии можно обнаружить М'Г в мокроте, если в 1 мл мокроты содержится не менее 10000—100000 палочек. В настоящее время под влиянием химиотерапии количество микробов в мокроте значительно снижается, что создает дополнительные трудности в выявлении возбудителя. В связи с этим в повседневной практике работы широко применяют методы обогащения и накопления микобактерий, которые позволяют концентрировать возбудителей туберкулеза в небольшом объеме материала. Совершенствуются и сами методы бактериоскопии и выделения возбудителя.

Мазки для микроскопии готовят из любого материала, полученного от больного (мокрота, кал, моча, плевральный экссудат, гной, спинномозговая жидкость).

Приготовление мазков из мокроты. Мокроту выливают в чашку Петри, под которую подкладывают лист черной бумаги, на фоне последней хорошо заметны жел-тогнойные комочки, которые и следует отбирать. Гнойные комочки деревянными заостренными палочками переносят на предметное стекло. Мазок готовят путем растирания комочков между 2 стеклами. Затем мазок высушивают на воздухе, фиксируют путем проведения мазка через пламя горелки и окрашивают по Цилю-Нильсену.

Окраска мазка по Цилю-Нильсену. На мазок наливают основной фуксин Циля и подогревают его до появления пара. После остывания мазка краску сливают и мазок промывают водопроводной водой, обесцвечивают 10—15 % раствором серной кислоты или 3 % раствором солянокислого спирта до появления бледно-розового цвета и после этого снова промывают водой. Затем мазок докрашивают 0,5 % раствором метиленового синего в течение 1/2 мин. Мазок промывают водой и высушивают.

На мазок наносят каплю кедрового масла и микроско-пируют. Микобактерии под микроскопом окрашены в рубиново-красный цвет в виде тонких прямых или слегка изогнутых палочек и располагаются единично или небольшими группами на сине-голубом фоне, в который окрашены вещество мокроты и различные клетки. При лечении химиопрепаратами микобактерии часто приобретают вид толстых и грубых палочек, похожих на кокки, и имеют более светлую окраску.

Бактериоскопия дает приблизительно на 10 % больше положительных результатов при использовании метода флотации, позволяющего в 5—10 раз увеличить концентрацию микобактерий.

Метод флотации заключается в том, что бензин, бензол, ксилол, толуол и другие углеводороды легче воды, добавленные в мокроту с водой, при встряхивании разбиваются на мельчайшие капельки, которые, поднимаясь кверху, адсорбируют на себе микобактерии.

В банку объемом 250 мл со стеклянными бусами вносят 10—15 мл мокроты (или другого исследуемого материала — кал, осадок мочи, экссудата и др.), добавляют примерно равное количество 0,5—1 % раствора едкого натра и встряхивают до полного разжижения мокроты. Затем добавляют 100 мл дистиллированной воды и 0,5—1 мл любого углеводорода и встряхивают в течение 5—10 мин. После этого в бутылку добавляют дистиллированной воды до горлышка и оставляют при комнатной температуре на 30—60 мин. На поверхности появляется беловатое пенистое флотационное кольцо, которое отсасывают пастеровской пипеткой с резиновым баллончиком и наносят на предметное стекло. По мере подсыхания капли на нее наносится новая порция. Наслаивание после подсыхания проводится 4—5 раз. После этого мазок фиксируют и окрашивают по Цилю-Нильсену.

Для концентрации возбудителя широко применяют также метод седиментации (осаждения). К мокроте прибавляют равный объем 10 % раствора натрия фосфата, который является хорошим гомогенизатором мокроты, не нарушает жизнедеятельность микобактерий и в то же время угнетает рост сопутствующей микрофлоры. После добавления натрия фосфата смесь инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч, затем центрифугируют 5—10 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость потом сливают, а осадок используют как для посева, так и для микроскопии.

Более чувствительной является люминесцентная микроскопия, которая на 20—30 % по сравнению с обычной увеличивает положительный результат. Этот метод основан на способности липидов микобактерий воспринимать люминесцентные краски, которые светятся при облучении их короткими синими или ультрафиолетовыми лучами. Светящиеся микобактерии хорошо видны. Мазок можно просматривать при малом увеличении гораздо быстрее, чем при объективе с иммерсией. Мазок готовят как обычно, фиксируют смесью Никифорова и пропитывают специальными красителями (флюорохромами): аурамином в разведении 1:1000 или родамином С. Затем мазок обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают кислым фуксином. Под микроскопом микобактерии светятся на темном фоне ярким золотисто-зеленым цветом. Микроскопию проводят в люминесцентном микроскопе или на обычном с опакиллюминатором (насадкой), пропускающим короткие синие и ультрафиолетовые лучи.

Недостаток метода микроскопии состоит в том, что он не позволяет безусловно дифференцировать патогенные и непатогенные микобактерии. С целью ориентировочной дифференциации патогенных и непатогенных микобактерий при микроскопии используют более длительное обесцвечивание мазков кислотой или спиртом. Сапрофиты после этого частично или полностью обесцвечиваются, а патогенные микобактерии удерживают окраску.

В последние годы появилась возможность отличать в мазках живые и мертвые микобактерии, что может служить дополнительным важным критерием оценки эффективности лечения. Суть метода состоит в том, что дезоксирибонуклеи-новая кислота (ДНК) живых микобактерий воспринимает окраску метиленовым зеленым, а у мертвых ДНК этой окраской не окрашивается. В то же время ДНК мертвых микобактерий может окрашиваться дополнительными красителями: пиронином, сафронином или карболовым фуксином.

Возбудитель туберкулеза — Mycobacterium tuberculosis

Наиболее надежным, достоверным и чувствительным методом диагностики туберкулеза является метод выделения чистой культуры микобактерий (бактериологический). Этот метод позволяет выявить микобактерии при содержании 20—100 возбудителей в исследуемом материале, увеличивает положительный результат на 15—30 %. Выделенную культуру можно изучить, дифференцировать от непатогенных микобактерий, определить ее вирулентность и устойчивость возбудителя к лечебным препаратам. Недостатками бактериологического метода являются сложность обработки материала и длительный рост возбудителя на средах.

Засеваемый материал гомогенизируют и одновременно обрабатывают серной или соляной 6 % кислотой или 4—6 % раствором едкого натра для уничтожения посторонней микрофлоры. Осадок после центрифугирования служит материалом для посева. Посев производят на яичную среду Левенштейна-Йенсена, которая рекомендована Всемирной организацией здравоохранения в качестве стандартной среды. Посев материала делают в 5 пробирок. При обработке материала серной кислотой вся процедура подготовки для посева должна быть выполнена быстро — в пределах 15 мин, так как более длительная экспозиция в кислоте снижает способность микобактерий к росту. Микобактерии вырастают на среде на 15—25-й день после посева. Жидкие материалы (моча, ликвор, экссудат, промывные воды желудка и бронхов) перед посевом необходимо центрифугировать и для устранения посторонней микрофлоры обработать осадок 3 % раствором серной кислоты в течение 20 мин. После этого обработанный кислотой материал повторно центрифугируют, а осадок используют для посева на среду. Ликвор, полученный стерильно, засевают без обработки кислотой.

Можно делать также посев мазка из гортани. Мазок берут ватным тампоном с надгортанника под контролем гортанного зеркала. Тампон помещают в небольшой объем 3—5 % раствора серной кислоты, отжимают его, а раствор центрифугируют. Осадок засевают на среду.

Иногда пользуются ускоренными методами посевов, из которых наиболее известен метод Прайса. Этот метод состоит в том, что подсушенный мазок мокроты после обработки его в серной кислоте и промывания погружают в пробирки с кровяной средой на 7—10 дней. Затем мазок промывают, сушат, фиксируют и окрашивают по Цилю-Нильсену. Применение для обработки мокроты поверхностно-активных веществ (лаурилсульфат; лауросепт и др.) значительно увеличивает рост микобактерий.

Для посева патологического материала используют плотные, полужидкие и жидкие питательные среды, но ни одна из них не обладает всеми необходимыми качествами. Поэтому посев делают на 2—3 различные среды. Чистые культуры выделяют на плотных, полужидких яичных и агаровых средах.

В настоящее время обязательно определение устойчивости микобактерий к стрептомицину, тубазиду и ПАСКу (парааминосалициловая кислота). С этой целью готовят набор сред Левенштейна с тремя разными концентрациями каждого препарата. Микобактерии, которые растут при концентрации 10 мкг/мл и более стрептомицина и ПАСКа и при концентрации 1 мкг/мл и более тубазида, считаются лекарственно-устойчивыми.

Большое значение в микробиологической диагностике туберкулеза имеет определение количества микобактерий в исследуемом материале для оценки тяжести процесса, тактики лечения и его эффективности.

Биологический метод исследования основан на заражении патологическим материалом морских свинок, которые очень чувствительны к туберкулезной инфекции. Этот метод признается более чувствительным для обнаружения микобактерий. Появление измененных под влиянием химиотерапии микобактерий иногда дает отрицательные результаты заражения животных при положительных результатах посева на среды. Это происходит в результате значительного снижения или полной утраты микобактериями вирулентности. С целью повышения количества положительных результатов морским свинкам перед заражением ежедневно вводят большие дозы кортизона, снижающего их резистентность. Через 3—4 нед после введения исследуемого материала морской свинке ставят туберкулиновую пробу. Положительная реакция будет свидетельствовать о присутствии микобактерий туберкулеза. Если животное не погибает через 3 мес, его забивают и различные ткани подвергают микроскопическому исследованию. Для целей диагностики этот метод в настоящее время имеет ограниченное применение, поскольку посев на питательные среды дает достаточно хорошие результаты.

Источник: http://tuberkulez.org/metody-obnaruzheniya-mikobakteriy-tuberkuleza.html

Методы обнаружения возбудителя инфекции в материале от больного

Методы прямого обнаружения возбудителя и его антигенов

В окрашенных или нативных (неокрашенных) препаратах, приготовленных из исследуемого материала, пользуясь обыч­ным микроскопом, можно увидеть возбудителей бактериальных инфекций (бактериоскопический метод)и протозойных инвазий (паразитологическое исследование). Например, при микроскопии препаратов крови обнаруживают возбудителей возвратного тифа и лептоспироза; при бактериоскопии осадка спинномозговой жидкости — менингококки и листерии; воз­будителей чумы находят при микроскопии мазков из пунктата чумного бубона, а бацилл сибирской язвы — в мазках-отпе­чатках, взятых с сибиреязвенного карбункула; в мазках с мин­далин удается обнаружить спирохеты и веретенообразные па­лочки, вызывающие ангину Симановского-Плаута-Венсана; скопления холерных вибрионов в виде стайки рыб можно уви­деть при бактериоскопии мазков каловых и рвотных масс.

Микроскопия широко используется для диагностики пара­зитарных болезней. В толстой капле и мазках крови могут быть обнаружены плазмодии малярии, в мазках крови и пре­паратах костного мозга — лейшмании, в крови, спинномозго­вой жидкости, пунктатах лимфатических узлов — токсоплазмы. Микроскопия дуоденального содержимого и испражнений необходима для диагностики лямблиоза. Возбудителей пневмоцистной пневмонии (СПИД-индикаторного заболевания) находят в мокроте. Основанием для диагностики глистных ин­вазий служит обнаружение яиц гельминтов при микроскопии кала (аскаридоз, дифиллоботриоз, гименолепидоз) или желчи (описторхоз, фасциолез).

Преимущество микроскопического исследования заключа­ется в его быстроте. Результаты анализа можно получить уже через несколько часов после забора материала. При некото­рых заболеваниях (малярия, возвратный тиф, менингококковая инфекция и др.) возбудителей удается обнаружить с пер­вого дня болезни и, таким образом уточнив диагноз, назначить своевременную этиотропную терапию.

Бактериологический метод. Метод основан на культивировании (выращивании) микроорганизмов. Наиболее широкое распро­странение в практике получил предусматривающий выделение возбудителей с последующей их идентификацией при посеве исследуемого материала на спе­циальные питательные среды.

Выбор материала и сроки его взятия определяет врач в со­ответствии с клиническими особенностями и периодом пред­полагаемого заболевания, местом избирательной локализации возбудителя и путями его выделения в окружающую среду. Так, возбудителей дифтерии выделяют при посеве слизи из зе­ва и носа, возбудителей кишечных инфекций (холеры, дизен­терии, эшерихиозов) — при посеве кала, рост возбудителей брюшного тифа выявляют при посевах крови, мочи, кала, жел­чи, а рост менингококков — в посевах слизи из носоглотки, крови, ликвора. Посев пунктатов лимфатических узлов осуще­ствляют для диагностики чумы, сапа и др. При выборе среды для выращивания учитывают биологи­ческие свойства микроорганизма. Нередко посев дублируют одновременно на нескольких питательных средах. Бактериологическое исследование позволяет получить пред­варительные положительные результаты уже с первых часов или дней болезни, однако окончательный ответ при большин­стве инфекций становится известным лишь через 2-4 дня, а при бруцеллезе, псевдотуберкулезе - через 2-4 нед., что обу­словлено различием в темпах роста микроорганизмов.

Вирусологический метод. При использовании вирусологического метода материал для исследования подвергают специальной обработке с целью очищения его от примесей слизи, клеток и бактерий. Культи­вируют вирусы (аденовирусы, вирусы гриппа, клещевого эн­цефалита и др.) в культуре клеток, на куриных эмбрионах с последующей идентификацией с помощью светового микро­скопа.

Биологический метод. Для выделения вирусов можно применять и заражение ла­бораторных животных, т. е. биологический метод. Например, энтеровирусы выявляют при заражении мозга мышей-сосун­ков, вирусы простого герпеса — при интраназальном введении исследуемого материала кроликам. Однако такой способ куль­тивирования слишком трудоемкий, дорогостоящий, требую­щий много времени, поэтому в диагностических лаборатори­ях практически не используется.

Биологический метод необходим для диагностики бактериальных инфекций (лептоспироз, бруцеллез, туляре­мия, чума). При этом заражают морских свинок, котят, крыс, мышей, а исследуемый материал (кровь больного, пунктат из не вскрывшегося бубона) животным вводят подкожно, внутрикожно, внутрибрюшинно или втирают в скарифицированную кожу. Применяется биологический метод и для обнаружения токсинов возбудителей, например, ботулотоксина.

Существенно расширились возможности специфической диагностики с внедрением в практику методов прикладной им­мунологии, основанных на взаимодействии антигенов и антител и позволяющих выявить в патологическом материале не только возбудителей, но и их антигены.

Источник: https://StudFiles.net/preview/4310886/page:12/
Похожие посты: